تکثیر قارچ دکمه ای با کشت بافت

برای کشت بافت ابتدا باید میسیلوم جوان و قوی را از یک کلاهک قارچ سالم و ترجیحا” از قسمت ساقه قارچ و با استفاده از وسایل و ابزار زیر تهیه نمود:

• اسکالپل
• الکل
• محیط کشت آگار ضدعفونی شده در پتری دیش یا بطری
• شعله آتش فاقد دود
• میز کارکه قسمت  روی آن ضدعفونی شده باشد و با ترجیحا” کابین Laminar  Flow یا کابین تلقیح.

روش کار

ابتدا قارچ را بطور کامل می شوییم .  را داخل الکل فرو برده و سپس روی شعله می گیرند تا به اندازه نزدیک به قرمز شدن گرم شود و سپس اجازه میدهیم تا در زمانی در حدود 10 ثانیه اسکالپل کمی سردتر گردد. سپس بخشی از قارچ بصورت طولی برش داده می شود به قسمیتی از قارچ که تازه برش داده شده است دست نمی زنیمو فقط با استفاده از اسکالپل از قسمت وسط آن به اندازه 2*2دمیلی متر جدا نمائیدو دقت داشته باشید که از سطح بیرونی قارچ که برروی دست مان قرار دارد، نمونه برداری نکنیم . بلافاصله پس از انجام  این کار درب پتری دیش را باز کنید . در هنگام باز نمودن درب پتری دیش با بطری یا لوله های ازمایش ابتدا قسمت درب ظروف  را نزدیک به شعله نمائید تا بر اثر گرما هرگونه آلودگی از قسمت درب زدوده شود. پس از باز شدن درب پتری دیش  اسکالپل حاوی نمونه را در قسمت وسط پتری دیش برده و بافت بریده شده را بر روی محیط کشت قرار دهید و بلافاصله درب پتری دیش را بگذارید . دفعات مایه کوبی و تلقیح معمولا” سه بار است اما در صورت امکان بهتر است بیشتر انجام شود.

پس از کشت بافت ، پتری دیش ها را برای مدت 10 روز در دمای 25 درجه سانتیگراد نگهداری کنید .میسیلیوم ها در عرض 4-3 روز بافت محیط کشت را پوشانده و درداخل آگار ریسه دوانی می نمایند. در صورتی که هیچگونه رشدی در داخل محیط کشت مشاهده نشود موارد ذیل را باید به دقت بررسی کنیم:

• مناسب بودن نوع محیط کشت در مورد این قارچ
• تهیه نمودن درست و صحیح محیط کشت (گاهی ممکن است PH مناسب نباشد)
• کهنه بودن بیش از حد نمونه قارچ
• داغ بودن اسکالپل در هنگام نمونه برداری که باعث داغ شدن و از بین رفتن میسیلیوم ها شده  است.

میسیلیوم ها در اکثر موارد و به استثنای میسیلیوم های مربوط به قارچ Morchella باید سفید رنگ باشند و در صورتی که میسیلیوم هایی به رنگ زرد ، آبی، سبز ویا خاکستری در بخش های دیگر محیط کشت دیده شود ناشی از الودگی قارچی می باشد. وجود بخش های رشد یافته کرمی رنگ و براق  نشان دهنده رشد باکتریایی است . در صورتی که میسیلیوم های رشد یافته قارچ کشت شده  با میسیلیوم های دیگر قارچ ها که بعنوان آلودگی مطرح می شوند مخلوط و ترکیب نشده است . بهترین کار این است که با ایجاد برش در محیط کشت و انتقال قسمت  سالم به محیط کشت جدید آن را تا حدی ایزوله نموده و مصون نگه دارید. بخاطر داشته باشید که هیچگاه اسکالپل را در تماس با قسمت های آلوده قرار ندهید و یا قسمت های آلوده را برش ندهید زیرا گاهی اوقات باایجاد یک برش جرئی ، میلیون ها اسپور قارچ از تمام سطح پتری دیش خارج شده و سبب الوده شدن سایر قسمت ها خواهند شد.